运行STAR执行mapping生成空BAM文件的原因及解决方法咨询

可能诱因 #

• 输入测序文件异常
  首先确认输入的fastq文件未损坏、非空，且前置处理步骤正确。你使用的是iCLIP测序数据，reads前端的NNNGGCGNN为UMI+barcode序列，若未提前切除就直接比对，随机序列会导致完全无法匹配参考基因组。也可执行zcat demultiplexed/demux_NNNGGCGNN.fastq.gz | head检查文件内容是否正常，读长是否符合预期。
• 参考基因组索引与注释不匹配
  你使用的hs88基因组索引需要和homo_sapiens.88.gtf.gz对应完全相同的参考基因组版本（如均为GRCh38/hg38），如果索引对应旧版本基因组、或索引构建过程出错损坏，也会出现全部reads比对失败的情况。
• 比对参数设置过严
  当前参数仅允许2个错配，若测序数据质量偏低、或存在未切除的接头序列，会导致几乎没有reads能满足比对要求被过滤。
• 日志信息不全导致问题定位困难
  你贴出的运行日志仅输出到开始比对阶段就直接结束，没有STAR的最终比对统计结果，无法直接判断是比对阶段无匹配reads，还是后续SAM转BAM步骤出错导致BAM为空。

修复方案 #

• 预处理测序数据：先用iCount的demultiplex模块或cutadapt切除reads前端的UMI、barcode以及3'端接头序列，仅保留有效cDNA序列用于后续比对。
• 校验参考索引与注释的一致性：若不确定索引版本，可重新构建STAR索引，执行命令：

  STAR --runMode genomeGenerate --genomeDir hs88 --genomeFastaFiles 参考基因组fasta文件路径 --sjdbGTFfile homo_sapiens.88.gtf.gz --sjdbOverhang 测序读长-1
  

  注意将测序读长-1替换为你实际测序读长减1的数值。
• 放宽比对参数测试：可先调整错配数为4，添加--mismatches 4参数运行测试，确认是否有reads能正常比对。
• 排查完整运行日志：进入输出目录mapping_NNNGGCGNN，查看Log.final.out、Log.out、Log.progress.out三个日志文件，确认比对率是否为0，或是否存在SAM转BAM阶段的报错。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者user12006540