如何运行Bismark亚硫酸氢盐测序程序？新手操作报错求助

1 环境配置修复（解决当前报错核心问题） #

• 统一所有文件存放路径，确保路径无中文、无空格、无特殊字符，参考目录结构如下：

  C:\Lab_Code\
  ├─ perl\          # Perl安装目录
  ├─ Bismark\       # 解压后的Bismark目录
  ├─ bowtie2\       # 解压后的Bowtie2预编译版本目录
  ├─ genome\        # 仅存放你的.fa格式基因组文件
  └─ clean_data\    # 存放Trim Galore修剪后的测序数据
  

• 将三个工具的可执行路径添加到系统环境变量PATH：
  1. 右键「此电脑」→「属性」→「高级系统设置」→「环境变量」
  2. 在系统变量列表中找到Path，点击「编辑」
  3. 依次新建三个条目：C:\Lab_Code\perl\bin、C:\Lab_Code\Bismark、C:\Lab_Code\bowtie2
  4. 依次点击所有弹窗的「确定」保存配置，关闭已打开的所有命令提示符窗口
• 验证环境配置有效性：重新打开Perl命令提示符，依次执行以下命令，输出版本信息无报错即为配置成功：

  perl -v
  bowtie2 --version
  bismark --version
  

注意：如果执行bowtie2 --version提示找不到命令，确认你下载的是Bowtie2的Windows预编译版本，不要直接使用GitHub上的源码压缩包，源码包需要自行编译才能运行。

2 基因组索引构建操作 #

你之前的报错核心原因是参数名错误（漏写了末尾的2）和路径识别异常，配置完环境后直接执行以下命令即可：

bismark_genome_preparation --path_to_bowtie2 C:\Lab_Code\bowtie2 --verbose C:\Lab_Code\genome

运行时长由基因组大小决定，动植物大基因组通常需要1-3小时，运行过程中不要关闭命令窗口。

3 测序数据比对操作 #

索引构建完成后，根据你的测序类型选择对应命令执行比对，结果会自动输出到指定的output目录：

• 单端测序数据比对命令：

  bismark --genome C:\Lab_Code\genome -o C:\Lab_Code\output C:\Lab_Code\clean_data\修剪后的单端数据文件名.fastq
  

• 双端测序数据比对命令：

  bismark --genome C:\Lab_Code\genome -o C:\Lab_Code\output -1 C:\Lab_Code\clean_data\read1文件名.fastq -2 C:\Lab_Code\clean_data\read2文件名.fastq
  

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Lost_in_Code