BWA-mem与sambamba比对时read group报错及SAMPLE变量定义问题

你遇到的[E::bwa_set_rg] the read group line is not started with @RG报错，核心原因是对bwa mem -R参数的作用存在认知偏差：

• -R参数的作用是写入符合SAM/BAM格式标准的@RG头信息，这是行业通用格式强制要求的，所有NGS分析工具（包括bwa、sambamba、GATK等）都只认@RG开头的RG行，不存在“配置工具识别@S开头read group”的选项——你看到的MGI测序read名里的@S200031047L1C001R002xxxx/1是read ID的前缀，属于序列名称的一部分，和SAM头里的Read Group元信息完全是两个东西。
• 你当前传入的-R '\@S200031047L1C001R002\S*[1-2]'既不符合@RG开头的格式要求，还错误写入了正则表达式：-R参数是直接接收字符串写入BAM头，不会做任何正则匹配，bwa检测到传入内容不符合格式就直接抛出错误。

正确的-R参数写法需要用制表符\t分隔必填字段，MGI平台测序数据的参考写法如下：

-R '@RG\tID:S200031047L1C001R002\tSM:对应样本名\tPL:MGI\tLB:对应文库名'

字段说明：

• ID：read group唯一标识，可以直接填你MGI测序的lane/flowcell编号（就是你之前写的S开头的那串标识）
• SM：样本编号，是后续所有分析（变异检测、定量、去冗余等）识别样本的核心字段
• PL：测序平台，填MGI即可
• LB：文库编号，单样本单文库可以直接和样本名保持一致，多样本文库需填写唯一标识

另外你原始read名末尾的/1、/2是双端测序的read1/read2标记，bwa会自动识别，不需要额外在参数里写正则匹配。

${SAMPLE}是shell脚本的自定义变量，作用是批量运行时自动替换为对应样本名，避免逐样本修改命令，常用两种配置方式：

1. 单样本临时运行：执行命令前直接在shell中赋值即可，注意提前创建输出目录，否则sambamba会因路径不存在报错：

# 替换为你的实际样本名
SAMPLE=sample_01
mkdir -p host_removal/${SAMPLE}
# 后续执行bwa+sambamba的整条管道命令即可

2. 多样本批量运行：先把所有样本名整理为纯文本列表（命名为sample_list.txt，每行一个样本名），通过while循环批量执行，参考脚本如下：

cat sample_list.txt | while read SAMPLE
do
  # 为每个样本创建独立输出目录
  mkdir -p host_removal/${SAMPLE}
  # 执行比对、排序流程，注意替换为你实际的fastq文件命名规则
  bwa mem  \
    -K 100000000 -v 3 -t 6 -Y \
    -R "@RG\tID:S200031047L1C001R002\tSM:${SAMPLE}\tPL:MGI\tLB:${SAMPLE}" \
    /path/to/reference/GCF_009858895.2_ASM985889v3_genomic.fna \
    /path/to/raw-fastq/${SAMPLE}_1.fq.gz \
    /path/to/raw-fastq/${SAMPLE}_2.fq.gz | \
  /path/to/genomics/sambamba-0.8.2 view -S -f bam /dev/stdin | \
  /path/to/genomics/sambamba-0.8.2 sort -m 8G /dev/stdin --out host_removal/${SAMPLE}/${SAMPLE}.hybrid.sorted.bam
done

额外注意事项 #

• 你原命令里fastq路径写的正则表达式'S\S[^_]*_L01_[0-9]+-[0-9]+'不会被shell自动解析，bwa会直接报文件不存在，不要在路径里写正则，要么用通配符*匹配，要么通过变量拼接准确的文件路径。
• sambamba sort默认分配的内存较小，处理大测序文件时容易崩溃，建议加-m参数指定可用内存（比如上面示例里的-m 8G，根据你服务器的实际内存配置调整即可）。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Gustavo de Miranda