Seurat对象子集化时sample函数的异常行为求助

问题现象 #

使用R语言Seurat包处理单细胞对象时，遇到如下异常：

• 提前生成随机细胞ID，再通过[]子集化，能得到不同的细胞集合，符合预期；
• 直接在[]子集化语句中调用sample函数，多次执行得到的子集完全相同，且不受随机种子影响。

复现步骤 #

1. 预生成随机ID子集（正常情况） #

library(Seurat)

set.seed(12345)

ten_cells_id <- sample(Cells(pbmc_small), 10)
other_ten_ids <- sample(Cells(pbmc_small), 10)
and_other_ten <- sample(Cells(pbmc_small), 10)

执行子集化后查看细胞标签，三组结果各不相同：

> Cells(pbmc_small[, ten_cells_id])
 [1] "CATGAGACACGGGA" "CGTAGCCTGTATGC" "ACTCGCACGAAAGT" "CTAGGTGATGGTTG" "TTACGTACGTTCAG" "CATGGCCTGTGCAT"
 [7] "ACAGGTACTGGTGT" "AATGTTGACAGTCA" "GATAGAGAAGGGTG" "CATTACACCAACTG"
> Cells(pbmc_small[, other_ten_ids])
 [1] "GGCATATGCTTATC" "ACAGGTACTGGTGT" "CATCAGGATGCACA" "ATGCCAGAACGACT" "GAGTTGTGGTAGCT" "GGCATATGGGGAGT"
 [7] "AGAGATGATCTCGC" "GAACCTGATGAACC" "GATATAACACGCAT" "CATGAGACACGGGA"
> Cells(pbmc_small[, and_other_ten])
 [1] "GGGTAACTCTAGTG" "TTTAGCTGTACTCT" "TACATCACGCTAAC" "CTAAACCTGTGCAT" "ATACCACTCTAAGC" "CATGCGCTAGTCAC"
 [7] "GATAGAGAAGGGTG" "ATTACCTGCCTTAT" "GCGCATCTTGCTCC" "ACAGGTACTGGTGT"

2. 直接在子集化中调用sample（异常情况） #

cells1 <- pbmc_small[, sample(Cells(pbmc_small), 10)]
cells2 <- pbmc_small[, sample(Cells(pbmc_small), 10)]
cells3 <- pbmc_small[, sample(Cells(pbmc_small), 10)]

Cells(cells1)
Cells(cells2)
Cells(cells3)

三次执行结果完全一致：

> Cells(cells1)
 [1] "GATAGAGATCACGA" "GGCATATGCTTATC" "ATGCCAGAACGACT" "AGATATACCCGTAA" "TACAATGATGCTAG" "CATGAGACACGGGA"
 [7] "GCACTAGACCTTTA" "CGTAGCCTGTATGC" "TTACCATGAATCGC" "ATAAGTTGGTACGT"
> Cells(cells2)
 [1] "GATAGAGATCACGA" "GGCATATGCTTATC" "ATGCCAGAACGACT" "AGATATACCCGTAA" "TACAATGATGCTAG" "CATGAGACACGGGA"
 [7] "GCACTAGACCTTTA" "CGTAGCCTGTATGC" "TTACCATGAATCGC" "ATAAGTTGGTACGT"
> Cells(cells3)
 [1] "GATAGAGATCACGA" "GGCATATGCTTATC" "ATGCCAGAACGACT" "AGATATACCCGTAA" "TACAATGATGCTAG" "CATGAGACACGGGA"
 [7] "GCACTAGACCTTTA" "CGTAGCCTGTATGC" "TTACCATGAATCGC" "ATAAGTTGGTACGT"

原因分析 #

问题根源在于Seurat包重载了R原生的[]运算符（即实现了[.Seurat方法）：

• Seurat的子集化方法在处理列（细胞）索引时，会对输入的表达式做额外的验证与标准化处理（比如转换为匹配细胞名的字符向量/逻辑向量）；
• 当直接传入sample(Cells(pbmc_small),10)这类动态表达式时，sample函数的求值时机被延迟到Seurat内部处理流程中，该流程可能重置了随机种子，或由于内部状态固定，导致每次sample调用都使用相同的随机初始状态，最终生成完全一致的结果；
• 提前将sample结果赋值给变量时，变量存储的是已生成的固定字符向量，子集化时直接使用该向量，自然不会触发上述问题。

而普通向量的[]是R原生实现，不会做额外处理，因此直接调用sample能正常生成随机结果。

解决方案 #

有两种方式可以避免这个问题：

1. 提前将sample的结果赋值给变量，再传入子集化语句（即第一种正常情况的做法）；
2. 手动强制sample表达式提前求值，用括号包裹：

cells1 <- pbmc_small[, (sample(Cells(pbmc_small), 10))]
cells2 <- pbmc_small[, (sample(Cells(pbmc_small), 10))]

这样sample会在Seurat的子集化方法处理前完成求值，生成不同的随机细胞子集。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者nico