基于BWA的链特异性比对问题咨询（遵循lentiMPRA流程）

方案1：构建链特异性参考基因组（推荐，解决MAPQ为0问题） #

1. 重新生成参考基因组：将每条原始序列及其反向互补序列设为独立contig，给不同链的contig加独特后缀（比如原序列ID是seq_001，正向contig命名为seq_001_plus，反向互补contig命名为seq_001_minus）
2. 用新参考构建BWA索引：

   bwa index chain_specific_ref.fasta
   

3. 常规执行BWA比对：

   bwa mem -t 8 chain_specific_ref.fasta reads_R1.fq reads_R2.fq > aligned.sam
   

4. 分离正反链序列：通过contig ID筛选，比如用samtools提取比对到_plus的reads：

   samtools view -b aligned.bam "*_plus" > forward_reads.bam
   samtools view -b aligned.bam "*_minus" > reverse_comp_reads.bam
   

   这种方式下每条reads只会匹配对应链的contig，不会因多比对导致MAPQ降低，下游流程可直接通过分离后的bam文件或contig ID处理，无需依赖SAM flags。

方案2：给reads添加链特异性标签（兼容现有参考） #

如果不想重构参考，可在比对后给reads加自定义标签，替代SAM flags用于下游区分：

1. 正常完成BWA比对得到bam文件
2. 用samtools和awk判断链方向，添加自定义标签（比如ZS:Z:PLUS/ZS:Z:MINUS）：

   samtools view -h aligned.bam | awk '
       BEGIN {OFS="\t"}
       /^@/ {print; next}
       {
           if(and($2, 16)) { tag = "ZS:Z:MINUS" } else { tag = "ZS:Z:PLUS" }
           print $0, tag
       }' | samtools view -b > tagged_aligned.bam
   

3. 下游流程可通过读取ZS标签区分正反链，避免依赖原始SAM flags的筛选逻辑，减少兼容性冲突。

方案3：分组合并比对（针对单端数据） #

如果是单端数据，可先拆分reads再预处理比对：

1. 根据实验设计的barcode或序列特征，将原始reads拆分为正向组和反向互补组
2. 对反向互补组执行序列转换：

   seqkit seq -r -p reverse_comp_reads.fq > rev_comp_converted.fq
   

3. 分别用BWA比对到原始参考：

   bwa mem ref.fasta forward_reads.fq > forward_aligned.sam
   bwa mem ref.fasta rev_comp_converted.fq > reverse_aligned.sam
   

   转换后两组reads都比对到正链，后续直接通过比对文件区分即可。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Le Qi