htseq-count无法生成预期读数计数，GFF文件属性缺失报错求助

我有如下GFF文件：

caffold1       GeneWise        mRNA    227302  283623  80.88   -       .       ID=Mnat_00001;evid_id=ENST00000360911;Shift=0;
scaffold1       GeneWise        CDS     227302  227498  .       -       2       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     230150  230298  .       -       1       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     233743  234426  .       -       1       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     236092  236835  .       -       1       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     238558  238807  .       -       2       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     240781  240970  .       -       0       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     241779  241912  .       -       2       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     249825  250005  .       -       0       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     273368  273452  .       -       1       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       GeneWise        CDS     283460  283623  .       -       0       Parent=Mnat_00001;
scaffold1       Cuff    mRNA    316222  341723  1000    +       .       ID=Mnat_00002;evid_id=CCG000108.1;source_id=CUFF.1168.1;
scaffold1       Cuff    CDS     316222  316368  1000    +       0       Parent=Mnat_00002;
scaffold1       Cuff    CDS     22468  322630  1000    +       0       Parent=Mnat_00002;
scaffold1       Cuff    CDS     325120  325274  1000    +       2       Parent=Mnat_00002;
scaffold1       Cuff    CDS     329797  329922  1000    +       0       Parent=Mnat_00002;

执行以下bash命令进行RNA-seq读数计数：

for i in *sorted.bam; do
   htseq-count $i Mnat_gene_v1.2.gff -f bam -i -mRNA -t CDS -m union -r name --stranded=no > ${i}_count.txt;
done

出现报错：

Error processing GFF file (line 2 of file Mnat_gene_v1.2.gff):
  Feature Mnat_00001 does not contain a 'mRNA' attribute
  [Exception type: ValueError, raised in features.py:387]

核心问题是htseq-count的参数配置错误：

• -i参数用于指定GFF文件中作为特征唯一标识的属性名，你写成了-i -mRNA，这会让程序错误地寻找名为mRNA的属性，但你的GFF里特征的标识属性是ID（比如mRNA行的ID=Mnat_00001，CDS行通过Parent=Mnat_00001关联到对应mRNA）。
• 错误的-i参数导致程序无法正确识别CDS对应的父特征，进而触发属性缺失的报错。

修正htseq-count的参数配置：

1. 将-i -mRNA改为-i ID，明确告诉程序使用GFF中的ID字段作为特征标识；
2. 若目标是统计mRNA转录本的读数，将-t CDS改为-t mRNA（因为CDS是mRNA的子特征，通常转录本或基因层级的计数更常用）；如果确实需要统计CDS的读数，保留-t CDS即可。

统计mRNA转录本的修正命令 #

for i in *sorted.bam; do
   htseq-count $i Mnat_gene_v1.2.gff -f bam -i ID -t mRNA -m union -r name --stranded=no > ${i}_count.txt;
done

统计CDS的修正命令 #

for i in *sorted.bam; do
   htseq-count $i Mnat_gene_v1.2.gff -f bam -i ID -t CDS -m union -r name --stranded=no > ${i}_count.txt;
done

• 确认你的BAM文件确实是按名称排序的（对应参数-r name），如果是按位置排序的，需改为-r pos；
• --stranded=no适用于无链特异性的建库方案，请根据你的实验设计确认参数是否匹配。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Allan Okwaro