Samtools mpileup读取输入文件出错，求酵母测序变异分析解决方案

核心问题 #

你的命令错误地将多个染色体FASTA文件作为参数传递给了samtools mpileup的-f选项——而-f仅接受单个参考基因组FASTA文件（需配套.fai索引）。后续的FASTA文件被samtools误判为输入比对文件（本应是BAM），导致"未知文件类型"的错误，同时错误提示中的"17 samples in 17 input files"也印证了这一点（samtools把17个染色体FASTA当成了17个输入样本文件）。

解决步骤 #

1. 合并染色体FASTA为单个参考文件 #

首先将所有染色体FASTA文件合并成一个完整的参考基因组文件：

cat /path/to/fasta/chr*.fa > /path/to/fasta/yeast_genome.fa

2. 生成参考文件索引 #

用samtools为合并后的FASTA生成索引（必须步骤，否则mpileup无法正常工作）：

samtools faidx /path/to/fasta/yeast_genome.fa

3. 修改R脚本命令 #

将脚本中的参考文件路径改为合并后的单个FASTA文件，同时用file.path替代paste来避免路径拼接错误：

vcf_file <- "pathway/to/stock/variants.vcf"
ref_file <- file.path(fasta_dir, "yeast_genome.fa")
system(paste("samtools mpileup -f", ref_file, merged_bam_file,
             "| bcftools call --ploidy 1 -mv >", vcf_file))

额外注意事项 #

• 确保merged_bam_file确实是单个合并后的BAM文件，且对应的.bai索引文件与BAM文件在同一目录下。
• 若不想合并FASTA文件，可针对每个染色体单独运行mpileup，最后用bcftools concat合并生成的VCF文件，但合并参考基因组是更简便的方案。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Juliette G.