Cell Ranger Arc分析NovaSeqX 10x Multiome数据时遇I2读取错误

问题背景 #

使用NovaSeq X完成10x Multiome测序，样本经测序中心拆分后，运行cellranger-arc count及上传10x云分析平台时均报错：无法读取read ID为LH00416:29:22GF7TLT3:4:1101:1259:1032 1:N:0:NGCGTTTC的barcode序列，提示无I2 read FASTQ且无法从FASTQ头读取16碱基barcode，需确认flow cell拆分正确性。已尝试调整文件命名及加载方式无效，无原始测序输出文件，仅持有拆分后的FASTQ文件，需自行排查。

排查步骤 #

• 检查拆分后FASTQ的完整性
  10x Multiome（ATAC+GEX）拆分后需包含对应I2索引的FASTQ文件（命名通常为*_I2_*.fastq.gz）。先列出所有FASTQ文件，确认是否存在I2文件：

  ls /path/to/your/fastqs | grep I2
  

  若不存在I2文件，说明拆分过程中丢失了关键的I2 read，这是核心问题。

• 验证FASTQ头与序列的barcode信息
  针对报错的read ID，提取对应R1文件中的序列信息，检查细胞barcode是否存在：

  zcat /path/to/your/R1_file.fastq.gz | grep -A3 "LH00416:29:22GF7TLT3:4:1101:1259:1032"
  

  查看输出的R1序列前16位是否为有效碱基（非全N）——这部分是10x的细胞barcode；同时确认FASTQ头末尾的NGCGTTTC是否为8bp样本barcode，若R1前16位异常（如长度不足、全N），说明拆分时barcode区域被错误截断。

• 检查I2索引的有效性
  若存在I2文件，验证其中的序列是否与你提交给测序中心的样本I2索引匹配：

  zcat /path/to/your/I2_file.fastq.gz | awk 'NR%4==2' | sort | uniq -c | head -20
  

  输出的序列应与样本索引表中的I2序列一致；若序列多样性极低或完全一致，说明拆分时未正确使用双索引（I1+I2），仅用单索引完成拆分，导致I2信息失效。

• 手动指定参数运行cellranger-arc测试
  若确认文件完整但命名不被自动识别，可手动指定参数快速测试（添加--no-bam减少运行时间）：

  cellranger-arc count --id=temp_test --reference=refdata-cellranger-arc-GRCh38-2020-A --fastqs=/path/to/fastqs --sample=your_sample_name --no-bam
  

  运行后查看temp_test/logs/cellranger-arc.log中的详细错误日志，定位具体是哪个read文件格式或路径问题。

• 确认NovaSeq X测序模式匹配性
  10x Multiome推荐使用NovaSeq X的SP flow cell测序，若采用PE flow cell，拆分时需调整read长度参数，否则可能导致barcode区域被错误截取。可通过测序报告确认flow cell类型及测序read长度设置是否符合10x官方要求。

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Jayden Ross