Samtools view -F/-f选项失效求助及按reads方向拆分BAM/SAM

你的所有操作错误根源都是命令参数顺序错误：-o选项必须紧跟输出文件名，你把flags参数放在了-o之后，导致Samtools误将flags值或长选项名当成了输出文件名，进而引发各种异常。

正确命令格式示例 #

基础格式 #

samtools view [flags参数] -o 输出文件名 输入BAM/SAM文件

按reads方向性拆分的常用命令 #

根据转录组测序的reads方向性需求，常用的flag组合如下：

• 提取正向链比对的配对reads（R1为反向互补、R2为正向，对应转录本正向）：

  samtools view -f 0x2 -f 0x10 -o forward_strand.bam aligned-input.bam
  

• 提取反向链比对的配对reads（R1为正向、R2为反向互补，对应转录本反向）：

  samtools view -f 0x2 -f 0x20 -o reverse_strand.bam aligned-input.bam
  

• 提取未比对的reads（对应flag 0x4）：

  samtools view -f 0x4 -o unmapped_reads.bam aligned-input.bam
  

• 排除未比对的reads（仅保留已比对的）：

  samtools view -F 0x4 -o mapped_only.bam aligned-input.bam
  

长选项的正确用法 #

使用--require-flags/--excl-flags时，同样要把输出文件参数放在选项和输入文件之间：

# 提取配对且正向链的reads（flag 0x1+0x10=0x11）
samtools view --require-flags 0x11 -o forward_paired.bam aligned-input.bam

# 排除未比对的reads（等价于-F 0x4）
samtools view --excl-flags 0x4 -o mapped_only.bam aligned-input.bam

验证方法 #

• 用samtools flags命令查询flag对应的含义：

  samtools flags 0x10
  # 输出：REVERSE        16 0x10 read is reverse complemented
  

• 用samtools flagstat验证拆分后的文件统计：

  samtools flagstat forward_strand.bam
  

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Matthew Urbano