使用PyDESeq2做RNA差异分析：应输入原始计数还是归一化计数？

关于输入计数的要求 #

• PyDESeq2 必须使用原始整数计数作为输入，绝对不能用TPM、RPKM或其他预归一化后的表达值。原因是PyDESeq2的核心统计模型基于原始计数的负二项分布特性，它会自行通过size factor校正来处理样本间测序深度的差异，预归一化后的数值会打破模型的统计假设，直接导致分析结果失真。

关于baseMean的含义 #

• baseMean不是所有样本原始计数的简单平均值。它是经过size factor校正后的样本计数均值：先对每个样本的基因计数用对应的size factor做校正（消除测序深度差异），再计算所有校正后数值的平均值，以此反映基因在所有样本中的整体表达水平。

用原始计数分析结果未达预期的排查方向 #

如果已经严格使用原始整数计数输入，那输入方式没有问题。结果不符合预期可以从这些方向排查：

• 实验设计是否准确：分组标签是否对应正确，是否存在未纳入模型的混杂变量（比如批次效应）
• 样本量是否充足：小样本量会导致统计效力不足，难以检测到真实的差异表达基因
• 低表达基因过滤是否缺失：建议先过滤掉在多数样本中表达极低的基因（比如至少在一半样本中计数≥10），这类基因的统计结果可靠性极低，还会干扰整体分析
• 参数设置是否正确：对比组是否设置错误，协变量是否正确纳入模型

内容的提问来源于stack exchange，提问作者Zach